O IMPACTO DA TÉCNICA DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
(PCR) NO DIAGNOSTICO DA TUBERCULOSE.
RESUMO
Este
trabalho pretande demosntrar o impacto das técnicas de biologia molecular no
diagnostico da tuberculose pulmonar e laríngea nos pacientes sintomáticos
respiratório assistido no serviços de saúde no município do Paulista – PE e as
mudanças nos protocolos de assistência medica e as consequência nas informações
e dados epidemiológicos decorrentes da implantação das técnicas da reação em
cadeia da polimerase.
O que muda
na logorritimo no diagnostico dos casos novos da tuberculose, nos exames de
controle do tratamento e documentação de cura e no diagnostico da infecção
latente por Mycobacterium tuberculosis. Contribuir no controle da doença no
município do Paulista.
ABSTRACT
This
work affect me pretande the impact of molecular biology techniques in the
diagnosis of pulmonary and laryngeal tuberculosis in symptomatic patients
assisted in respiratory health services in the municipality of Paulista – PE
and changes in medical protocols and the consequence on the epidemiological
information and data resulting from the implementation of the techniques of the
polymerase chain reaction.
What
changes in logorritimo in the diagnosis of new cases of tuberculosis, exams and
treatment documentation control and healing diagnosis of latent infection by
Mycobacterium tuberculosis. Contribute to the control of the disease in the
municipality of Paulista
INTRODUÇÃO
Tuberculose é uma doença
infecto-contagiosa crônica de distribuição mundial causada pelo bacilo
de Koch (Mycobacterium tuberculose). Ela tem preferência pelo pulmão, podendo
infectar outros órgãos e tecidos. Transmissão ocorre de forma direta através da tosse, espirro, ou escarro de
pessoas contaminadas no estado baciliferas, sintomáticas ou não, quanto
gotículas de secreção do pulmão são expelidas no ar
Este trabalho pretende analisar o
impacto da utilização das técnicas de
biologia molecular , reação em cadeia da Polimerase em tempo real ( PCR-RT), no
diagnostico da tuberculose no laboratório do município do Paulista estado de Pernambuco
da rede de laboratório dos município prioritários do programa nacional do
controle da tuberculose (PNCT) do
Ministério da Saúde (MS) CEAMP
(Centro de endemias e Analises Medicas d Paulista).
Demonstra o que muda com a
utilização dos métodos de biologia molecular usados no laboratório municipal da
prefeitura do Paulista (CEAMP) relação as fases pré analítica, analítica e pós
analítica e nos algoritmos no diagnostico clinico dos casos novos ( pacientes que nunca tiveram tuberculose) e
no acompanhamento dos pacientes em tratamento
e na documentação de cura e nos pacientes de retratamento por abandono e
recidiva e dos pacientes com infecção latente
.
Identificar a
presença de resistência primaria quando paciente caso novo e de retratamento
são diagnosticado com a detecção do DNA
mutante do gene rpoB que confere resistência ao antibiótico Rifampicina
ao bacilo Mycobacterium tuberculosis (MTB)
Verificar as mudanças decorrente da
implantação das técnicas de biologia celular, Reação em cadeia da polimerase em
tempo real (PCR-RT) nos índices epidemiológicos da tuberculoses no município do Paulista – Pernambuco.
Indicar nos estágios da doença de
acordo com as evidencias do processo
patológicos, qual a técnica de diagnostico da tuberculose, reação
intradermica (Teste tuberculino), baciloscopia com coloração Ziehl Neelsen,
cultura do escarro e reação em cadeia da polimerase em tempo real é mais
indicada de eleição e quando não é indicado o emprego da PCR-RT.
1.2 Problema
O
diagnostico precoce da tuberculose é importante para evitar o
agravamento do paciente e conter a proliferação da doença na comunidade.por ser
o próprio homem o vetor do agente transmissor da doença o Mycobacterium tuberculosis.
Identificar o método de
diagnostico laboratorial de eleição no diagnostico precoce da tuberculose
pulmonar e laríngea.
.Determinar qual o método indicado no controle de
tratamento e documentação de cura ou falência..
Avaliar a presença de resistência a
antibióticos e infecção latente.
O que muda na intervenção diagnostica com as
técnicas de biologia molécula,r como a reação em cadeia de polimerase em tempo
real (PCR-RT) nos paciente sintomáticos respiratórios atendidos na rede de
saúde publica no município do P)aulista no estado de Pernambuco
1.3
Justificativa
A tuberculose é uma das doenças mais antigas que afligem a humanidade e
constituí uma das principais causas de morbidade e mortalidade em nosso pais,
atingindo indistintamente diversas faixas etárias e classes sócias. O Centro de Endemias e Analises Médicas do
Paulista CEAMP é o laboratório de saúde publica, do município do Paulista – PE
responsável pela realização dos exames de diagnostico da tuberculose. E integra
a rede de laboratório dos municípios prioritário do Programa Nacional de Controle
da Tuberculose (PNCT) do Ministério da saúde.
Com este trabalho esperamos demonstrar a
importância do exame do escarro pelo
método de Reação em Cadeia de Polimerase em tempo real (PCR ) como teste
de rotina para diagnostico e triagem de resistência a antibióticos . Contribuir
de forma efetiva na melhoria da diminuição dos índices de morbidade e
mortalidade a nível municipal. Estimar o
impacto em condições programática da implementação do Teste de PCR, e as taxas
de detecção da tuberculose pulmonar, e detecção de tuberculose pulmonar
multidrogas resistente, e qual suas limitações. E contribuir com a confirmação
laboratorial dos caso de tuberculose pulmonar e laríngea e a diminuição do
tempo do inicio do tratamento. Subsidiar ações de enfretamento deste agravo no
âmbito municipal, bem como na formulação de estratégia em saúde publica para o
controle da morbidade e mortalidade pela tuberculose.
1.4
Objetivos:
1.4.1 Objetivo geral:
Demonstra
a importância dos teste moleculares, Reação
em Cadeia de Polimerase em tempo real. Compara
aos demais métodos de diagnósticos laboratoriais da tuberculose pulmonar
e laríngea, baciloscopia , cultura e teste tuberculina (Mantoux).Nos
exames realizados no CEAMP – Município do Paulista - PE
1.4.2 Objetivos específicos:
Avaliar
os dados epidemiológicos da população sintomáticos respiratório do município do Paulista – PE.
Demonstrar os
índices de especificidades das técnicas utilizados no diagnostico da
tuberculose pulmonar
Analisar a sensibilidade na identificação do
agente etiológico por técnica empregada, e os índices de precisão e exatidão dos métodos utilizados no
diagnóstico laboratorial do tuberculose pulmonar e laríngea e infecção latente.
Avaliar o que muda na intervenção diagnostica
da tuberculose a nível de atenção básica e nos procedimentos laboratoriais e
conduta médica.
Meu referencial teórico
Neste trabalho analisa-se o impacto do uso das técnica de biologia
molecular (PCR-RT) no diagnostico da tuberculose e sua influencia nas ações de
saúde publica. Entender e identificar o momento exato no desenvolvimento do
processo patológico de uma morbidade
infecciosa,onde através de intervenções
diagnosticas com uso de técnicas laboratoriais de diagnostico, se verifique as
alterações e evidencias que possam ser mensurada ou demonstrada, através do
isolamento do agente etiológico, respostas imune e alterações histológica e
anatômicas e a instalação da doença no organismo
A tuberculose é uma doença que acompanha nos seres humanas através da
historia. No Brasil provavelmente foi
introduzido no século XVI pelos europeus
colonizadores.segundo Lourival Ribeiro,
um dos primeirosportador da tuberculose foram os padres jesuítas que em suas
misões disseminaram a tuberculose entre os indígenas no Brasil. Em 1882 foi descoberto o bacilo causador da
tuberculose o tratamento e diagnostico seguiu um novo rumo.
Na cidade do paulista região metropolitana do
Recife no estado de Pernambuco as ações de vigilância epidemiológica e diagnostico
laboratorial tiveram inicio nos fins dos anos 1970 com criação do laboratório
municipal o CEAMP ( Centro de endemias e Analises medicas do Paulista) o
laboratório integra a rede de laboratório do serviço de diagnostico de
tuberculose do (PNCT) Programa Nacional de Controle da tuberculose do
Ministério da Saúde (MS) que tem como
principal objetivo detectar, monitorar a evolução do tratamento e documentar a
cura através do exame microscópio do escaro-baciloscopia.
Na construção de um programa nacional de controle da Tuberculose (PNCT).
O objetivo principal dos serviços laboratoriais de diagnostico de tuberculose
deve ser o de detectar casos de tuberculose pulmonar, monitorar a evolução do
tratamento e documentar a cura no fim do tratamento por meio de exames
microscópico de escarro-baciloscopiaDenomina-se “caso de tuberculose” todo
individuo com diagnostico confirmado por baciloscopia ou cultura e aquele que o
médico, com base nos dados clínico-epidemiológico e no resultados de exames
complementares, firma o diagnostico da tuberculose. “Casos novos” é o doente de
tuberculose que nunca usou ou usou por menos de um mês drogas antituberculosas.
Manual de Vigilância Epidemiológica FUNASA MS 2002 p11
O CEAMP tem sua atuação em uma área de 97.312Km² e uma
população de 310.000 habitantes segundo
senso do IBGE 2010. 46 unidades básicas de saúde que recebem os escarros para
exames para diagnósticos da tuberculose
A tuberculose é doença infecciosa de evolução crônica que tem como
agente etiológico o Mycobacterium tuberculosis, descoberto por Robert Koch em
1882 sua morfologia são bacilar retos ou encurvados com dimensões em media de
0,2 micra a 0,6 micra por 1 micra a 10 micra , imóvel e não formadores de
esporos ou capsula seu crescimento é
variável podendo ser rápido cerca de 3 horas nas cavidades pulmonares e lento
em lesões fechadas e intracelular em torno de 18 a 20 horas, são aeróbios
estritos.depois de que os agentes etiológicos da tuberculose (Tb) e da
Hanseniase tinha características morfológicas de bacilos e tintorial de álcool
acido resistência , Lehmann e Neumann, 1896, agrupavam os agentes
como pertencentes ao gênero Mycobacterium , estabelecendo as espécie Mycobacrium
tuberculosis e M. leprae respectivamente, atualmente foram visualizadas e isoladas
125 especie e 11 sub-especie reconhecida oficialmente essas epecie são
divididas em dois grupos: as pertencentes ao complexo M. tuberculosis e as micobacterias não causadora da
tuberculose (MNT) A principal via de
entrada no organismo humano para o M.tb
são as vias aéreas. Por sua característica com aeróbio estrito o bacilo
infecta principalmente os pulmões, que oferece condições favorável de oxigênio
para sua implantação e multiplicação e a ligação do órgão com o meio
externo favorece sua transmissão. Os bacilos eliminados pela tosse
estão aptos a infectarem novos hospedeiros . Ao atingir a
periferia dos pulmões os bacilos são fagocitados pelos Macrófagos alveolares ai
existentes o que desencadeiam o processo
de resposta imune Os Macrófagos alveolares fagocitam os bacilos e conseguem
destruí-los no Interior dos lisofagosoma. Em pacientes vacinados ou com
infecção anterior e Sem imunosupresão a infecção é barrada nesta fase. O que
evita uma disseminação hematogênica primária. Os bacilos parasitos intracelulares
facultativos, alcança um crescimento logarítmico no interior dos
macrófagos e das células atraídas por
citosinas por ele produzidas como o Neutrófilos e Monócitos, Os Neutrófilos por
produzirem protéses destroem o cimento dos vasos e dos alvéolos e formam um
processo inflamatório inespecífico (imunidade inata). Adicionalmente estes
Neutrófilos e Monócitos ( que se transforma em Macrófagos) Contendo bacilos em
seu interior retomam a corrente sanguínea disseminando por todo organismo. Quando
a lesão evolui em torno de 3 semanas, começa a se constituir uma reação
Inflamatória granulomatosa mediada por linfócitos T (Imunidade adquirida) com aparecimento da hipersensibilidade
celular mediata pelo linfócitos T e
Resposta positiva do teste tuberculínico (TT)
Reação de Mantoux, nesta fase simbiótica entre o Bacilo e o hospedeiro,
o processo inflamatório não evolui e não produz
sintomas. (CONDE 2010 P 34).
Neste momento a única intervenção diagnostica eficaz o uso do TT da PPD
(Proteína Purificada Derivada) na reação intradermica e pesquisa de anticorpos
anti o bacilo M.Tb é o momento ou fase da infecção latente onde as outras
técnicas de diagnostico são ineficaz neste período ou fase o paciente não
expeli o bacilo (fase não bacilíferas) a doença pode terminar ou estacionar
neste fase a depender da eficiência do
sistema imune do hospedeiro.
Nesta fase, forma-se uma necrose
central de conteúdo lipídico, a necrose caseosa, no Qual o bacilo se protege e
hiberna. Se captar oxigênio do metabolismo tecidual tem crescimento
intermitente, porem, em caso de metabolismo nitrogênico, anaeróbico, tem
crescimento lento. A imunidade adquirida
mediada por linfócitos T encontra sua plenitude. A reação granulomatosa constitui
um cerco de células mantidas ativas por mediação dos linfócitos T seja
induzindo a atividade macrofagica ou provocando uma apoptose em macrófagos
inativos. Nesta fase o granuloma forma um cerco de células competentes
disciplinadas pelo Linfócito T que se mantém ativa devido a formação do TNF-alfa que resulta da necrose provocada
pela atividade bacilar, nesta etapa o bacilo e dissemina por via
linfo-hematogênica e alcança o próprio pulmões via ducto torácico e veia cava
superior e reinplanta-se nos ápice pulmonares, onde encontra Oxigênio e baixo aporte de células imunocompetentes.
Se o processo inflamatório evoluir precoce ou
tardiamente, seja por um processo sistêmico de imunidade deprimida ou local, a
necrose caseosa se liquefaz e forma uma cavidade que tende a disseminar os
bacilos que são expelidos pela via respiratória superior através da tosse ou
mesmo a fala.
Neste momento o paciente passa a ser sintomático respiratório então
nesta fase da doença é possível realizar o diagnostico laboratorial com o
isolamento e identificação do bacilo. Embora com os avanços tecnológicos e
modernas técnica na micobacteriologia entretanto a baciloscopia ou pesquisa do
bacilo álcool acido resistente (BAAR) corada pelo método Ziehl Neelsen seguindo técnica padronizada de observação ao
microscópio ótico de campo claro. A baciloscopia é realizadas em duas amostra de escarro colhido em dias
subsequente em pacientes sintomáticos
respiratório com a finalidade de diagnostico e também nos casos positivo após o
inicio do tratamento uma amostra mensal até o 6 mês como controle de tratamento
e documentação de cura ou falência . Manual de vigilância laboratorial da
tuberculose e outras Micobácterias
2008 p 13
Com a implantação da técnica de biologia molécula de reação em cadeia da
polimerase em tempo real nos laboratórios dos municípios prioritário da a rede
de laboratório participantes do (PNCT)
A Reação em
Cadeia da Polimerase, no momento o teste mais usado, permite a detecção de
quantidades mínimas de material genético, sendo o precursor dos métodos
baseados na Biologia Molecular. Tuberculose Guia de vigilância Epidemiológica
FUNASA MS 2002 p 15
A reação em cadeia da polimerase (PCR) e suas
variações, como a nested-PCR, têm sido destacadas como técnicas moleculares
promissoras para o diagnóstico rápido da tuberculose (TB). Diagnostico
Molecular da tuberculose pulmonar Assis, Nelma Cristina 2007 p 137
Ocorreram mudanças nos procedimentos e na qualidade e
no tempo do processamento pré- analítico no analítico e pós- analítico. a nível
pré analítico diminui o numero necessário de amostra de escarro, no teste
molecular é necessário apenas uma amostra com volume mínima de 1 ml para
amostras pulmonares. Serão incluídas para teste as amostras pulmonares
(escarro, escarro induzido e lavado broncoalveolar (LBA) e extrapulmonares
(líquido cefalorraquidiano-LCR, linfonodos, outros tecidos e lavado gástrico) .
Também podem ser processados os sedimentos previamente preparados para cultura
de micobactérias. Critérios
de exclusão de amostras não devem ser processadas:
Amostras constituídas
exclusivamente de saliva;
Amostras que
contenham partículas de alimento;
Amostras constituídas
exclusivamente de pus (sem muco e esverdeadas);
Amostras constituídas
exclusivamente de sangue;
Amostras com
quantidade inferior a um (1) ml, no caso de amostras pulmonares e
extrapulmonares, exceto LCR;
Amostras de LCR com
quantidade inferior a 0,1 ml
Algoritmos do PNCT – Ministério da Saúde
Nos algoritmos do Ministério da Saúde (anexos 1, 2 e
3) são encontradas as indicações de realização do teste em amostras pulmonares
de adultos para a população em geral e para as populações mais vulneráveis, bem
como os encaminhamentos necessários de acordo com resultado do teste. Sempre se
deve lembrar que em qualquer caso o teste só é indicado para diagnóstico de
pacientes que nunca trataram tuberculose anteriormente ou que não estejam em
tratamento.
Para os casos de retratamento o teste poderá ser
realizado para identificação da resistência à rifampicina, o diagnóstico da
tuberculose deverá ser realizado pela baciloscopia e/ou cultura para
micobactérias.
No caso de crianças ou de extrapulmonares não utilizar
o algoritmo. Para crianças o TRM-TB é uma ferramenta auxiliar, devendo ser
utilizado o escore clínico para diagnóstico da tuberculose em crianças naqueles
com TRM-TB ou baciloscopia negativos.
O teste não identifica micobactérias não
tuberculosas (MNT). Em caso de suspeita de MNT, solicitar cultura com
identificação de espécie no processo de investigação diagnóstica.
Equipamentos,
vidraria, material
•
Sistema GeneXpert®
( equipamento GeneXpert, computador e leitor de código de barras)
•
Nobreak
•
CSB (desejável, mas
não obrigatório)
•
Agitador (desejável,
mas não obrigatório)
•
Geladeira
•
Bico de Bunsen
Insumos
•
Kit Xpert MTB/RIF
para 10 ou 50 testes
•
Pipeta Pasteur descartável
•
Tubo Falcon de 15 ml
•
Caneta marcadora
•
Cronômetro
•
Luvas descartáveis
•
Respiradores N95
•
Aventais de laboratório
•
Papel toalha
•
Desinfetantes
•
Sacos de lixo autoclavável
Preparo das amostras pulmonares (escarro, escarro induzido e LBA)
Obs.1:Processe de cada vez apenas as amostras suficientes
para os módulos disponíveis para a execução do teste no sistema GeneXpert Dx.
As orientações de biossegurança sobre o manuseio de TB devem ser rigorosamente
cumpridas.
Obs.2:Deve ser realizado o
exame de cultura para micobactérias e teste de sensibilidade para as amostras
pulmonares de acordo com os algoritmos recomendados pelo PNCT – Ministério da
Saúde.
a. Deixe a amostra no pote de coleta do escarro.
b. Para cada amostra, abra a tampa do pote e adicione o
reagente de amostra na proporção 2 volumes de reagente para 1 volume de amostra
(2:1) e agite vigorosamente de 10 a 20 vezes (ou use o vórtex). Um movimento
para a cima e para baixo corresponde a uma agitação.
Obs. 1: o
volume 2:1 de reagente e amostra não necessita ser exato, mas como exemplo:
para 1 ml de amostra adicione 2 ml de reagente; 2 ml de amostra – 4 ml de
reagente.
Obs. 2: o
volume mínimo de escarro para preparação é de 1 ml.
c. Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.
d. Agite vigorosamente de 10 a 20 vezes (ou
use o vórtex).
e. Incube
mais 5 minutos a temperatura ambiente
f. Verifique se as amostras estão
totalmente liquefeitas, sem qualquer viscosidade. Caso não estejam totalmente
liquefeitas agite novamente e deixe em temperatura ambiente por mais 5 a 10
minutos. A etapa de descontaminação e liquefação não deve ultrapassar 35
minutos no total.
Preparação de amostra para cultura e Xpert MTB/RIF
a. Prepare a amostra usando os métodos de
descontaminação (Petroff ou Nalc) para a realização da cultura.
b. Coloque 0,5 ml do sedimento usado para
inoculação dos meios de cultura em um tubo Falcon após o sedimento ter sido
semeado nos tubos de meio de cultura.
c. Adicione
1,5 ml do reagente da amostra ao tubo Falcon.
d. Incube durante 15 minutos a temperatura
ambiente.
e. Transfira com a pipeta fornecida no kit
no mínimo 2 ml para o cartucho.
f. Iniciar
o teste.
Preparo do cartucho
OBS.:
Não toque no tubo de reação do
cartucho (figura abaixo).
a. Identifique cada cartucho Xpert MTB/RIF com o número
da amostra (escreva nos lados do cartucho ou afixe uma etiqueta de código de
barras). Não coloque a etiqueta na tampa do cartucho nem obstrua o código de
barras 2D existente na frente do cartucho.
b. Abra
a tampa do cartucho.
c. Usando a pipeta de transferência
esterilizada fornecida, aspire a amostra liquefeita para a pipeta de
transferência até o menisco estar acima da marca presente na pipeta. Não
prossiga com o processamento da amostra no caso do volume ser insuficiente. É
muito importante que seja inserido no cartucho 2 ml ou mais da amostra
processada.
d. Transfira a amostra para o orifício localizado no lado
direito da parte superior do cartucho Xpert MTB/RIF, que aparece quando se levanta
a tampa (figura abaixo). Dispense a amostra lentamente para evitar a formação
de aerossóis e bolhas.
Nota: NUNCA COLOQUE A AMOSTRA NO ORIFÍCIO CENTRAL DO CARTUCHO
e. Feche a tampa do cartucho.
Certifique-se de que a tampa fique bem encaixada. O restante da amostra
preparada pode ser conservado até 12 horas a 2 – 8 °C, para o caso de ser
necessário repetir o teste.
Importante: certifique-se de que o teste seja iniciado 30 minutos
após a preparação do cartucho. Este é o procedimento ideal, porém, se
necessário, o cartucho (com a amostra preparada) pode permanecer até 4 horas a
temperatura ambiente antes do início do teste.
Início do teste
a. Na janela do sistema GeneXpert Dx, clique em Create Test (Criar teste). É apresentada a
caixa de diálogo “Scan Cartridge Barcode” (Ler código de barras do cartucho).
b. Com o cartucho sobre a bancada, leia o código de
barras do cartucho Xpert MTB/RIF. Utilizando as informações do código de
barras, o software vai preencher automaticamente as caixas dos campos
seguintes: Select Assay (Selecionar ensaio), Reagent Lot ID (ID do lote de
reagente), Cartridge SN (No série do cartucho) e Expiration Date
(prazo de validade do cartucho).
c. Na caixa Sample
ID (ID da amostra), leia com código de barras ou introduza a ID da amostra.
Certifique-se de que introduz a ID correta da amostra.
A ID da
amostra estará associada aos resultados do teste e será apresentada na janela View Results (Ver resultados) e em todos os
relatórios.
d. Clique em Start Test (Iniciar teste). Na caixa de
diálogo apresentada (login), introduza seu login e a sua senha.
e. Abra a porta do módulo do instrumento com a luz verde
a piscar e coloque o cartucho.
f. Feche a porta. O teste inicia-se e a luz verde para de
piscar. Quando
o teste termina, a luz se apaga.
g. Antes de abrir a porta do módulo e retirar o cartucho,
aguarde até o sistema desbloquear a porta.
h. Descarte os
cartuchos usados nos coletores adequados para resíduos biológicos, de acordo
com as práticas de biossegurança do CEAMP ou da sua instituição.
Conteúdo do
laudo a ser enviado à Unidade de Saúde
Nome do teste: Teste Rápido Molecular
para Tuberculose
Método: PCR em Tempo Real
Resultado:_________________ (colocar conforme
opções abaixo)
1.
Mycobacterium
tuberculosis: não detectado
2. Mycobacterium
tuberculosis:
detectado
Se MTB detectado: Resistência a rifampicina:
não detectada
Resistência a rifampicina:
detectada
Resistência a rifampicina: indeterminada -
solicitamos nova amostra para realização da cultura e teste de sensibilidade
3. Teste inválido – solicitamos nova amostra
para repetição do teste
Interpretação
dos possíveis resultados
Os resultados são interpretados
pelo sistema GeneXpert Dx a partir dos sinais de fluorescência medidos e dos
algoritmos de cálculo incorporados, sendo apresentados na janela "View
Results" (Ver resultados). Valores de Ct mais baixos representam uma
concentração inicial de modelo de DNA mais elevada; valores de Ct mais altos
representam uma concentração inicial de modelo de DNA mais baixa.
Os
resultados possíveis estão listados abaixo:
a. MTB não
detectado (MTB not detected)
Não foi detectado o DNA-alvo do
MTB.
SPC—Pass (SPC—Aprovado); o SPC tem
um intervalo válido de Ct e um endpoint acima do valor mínimo.
Probe Check—PASS (Verificação da
sonda—APROVADA); todos os resultados de verificação da sonda foram aprovados.
b. MTB
detectado (MTB Detected)
Foi detectado o DNA-alvo do MTB.
O resultado MTB é apresentado como
High, Medium, Low ou Very Low (alto, médio, baixo ou muito baixo) dependendo do
valor do Ct do alvo MTB presente na amostra.
A Tabela 1 lista o intervalo dos
valores do Ct para os resultados de MTB apresentados.
b.1 Resistência à rifampicina
Os resultados referentes a rifampicina serão apresentados
apenas nos resultados MTB DETECTADO e numa linha diferente deste. Os resultados de rifampicina podem
ser:
·
Resistência à Rif DETECTADA (Rif Resistance DETECTED)
Foi detectada uma mutação no gene rpoB que está
dentro do valor delta de Ct válido.
·
Resistência à Rif INDETERMINADA (Rif Resistance
INDETERMINATE)
A concentração de MTB é muito baixa e não foi possível
determinar a resistência.
·
Resistência à Rif NÃO DETECTADA (Rif Resistance NOT
DETECTED)
Não foi detectada mutação no gene rpoB.
SPC— NA (não aplicável); o sinal de SPC não é
necessário na medida em que a amplificação do MTB valida o teste.
Probe Check—PASS (Verificação da sonda—APROVADA);
todos os resultados de verificação da sonda foram aprovados.
c. MTB Inválido (INVALID)
A presença ou a ausência de MTB não
pode ser determinada. Repita o teste com a amostra restante ou solicite nova
amostra. O SPC não preenche os critérios de aceitação, a amostra não foi
processada adequadamente ou o PCR foi inibido.
SPC—FAIL (SPC—NAO APROVADO); o
resultado do alvo do MTB é negativo e o Ct do SPC não esta dentro do intervalo
válido.
Probe Check—PASS (Verificação da
sonda—APROVADA); todos os resultados de verificação da sonda foram aprovados.
d. ERRO
(ERROR)
MTB—SEM RESULTADO (MTB—NO RESULT)
SPC—SEM RESULTADO (SPC—NO RESULT)
Probe Check—FAIL* (Verificação da sonda NÃO
APROVADA)*; um ou mais resultados da verificação da sonda falharam.
*Se a verificação da sonda for aprovada, o erro é
causado por uma falha de um componente do sistema.
e. Sem
resultado (NO RESULT)
MTB—SEM RESULTADO (MTB—NO RESULT)
SPC—SEM RESULTADO (SPC—NO RESULT)
Probe Check - NA (Verificação da sonda - não
aplicável)
Motivos para repetir um
ensaio
Repita o
teste com um cartucho novo ou dê início a procedimentos alternativos, caso ocorra
um dos seguintes resultados de teste:
• Um
resultado INVÁLIDO indica que o SPC falhou. A amostra não foi processada
corretamente ou o PCR foi inibido.
• Um
resultado com ERRO indica que o controle de verificação da sonda falhou e que o
ensaio foi cancelado, possivelmente devido ao enchimento inadequado do tubo de
reação, à viscosidade da amostra, à detecção de um problema de integridade da
sonda de reagente, porque os limites máximos da pressão foram excedidos ou
porque há falha num módulo do GeneXpert.
• SEM
RESULTADO indica que os dados recolhidos foram insuficientes. Por exemplo, o
operador parou um teste que estava em andamento ou faltou energia elétrica.
Controle de
qualidade
O controle de qualidade é realizado
automaticamente em cada cartucho, ou seja, o controle está dentro do cartucho e
é realizado para cada amostra processada no equipamento, dispensando o usuário
de realizar controles como feitos rotineiramente em provas “in house” de PCR.
Cada teste inclui um controle de
processamento da amostra (SPC) e um controle de verificação da sonda (PC).
O controle de processamento da amostra (SPC) assegura
que a amostra foi corretamente processada. O SPC contém esporos não infecciosos
sob a forma de um bolo de esporos secos que é incluído em cada cartucho para
verificar o processamento adequado do MTB. O SPC verifica se ocorreu a lise do
MTB, se os organismos estiverem presentes, e verifica se o processamento da
amostra foi adequado. Adicionalmente, este controle detecta a inibição
associada à amostra do ensaio de PCR em tempo real. O SPC deve ser positivo
numa amostra negativa e pode ser negativo ou positivo numa amostra positiva. O
SPC é aprovado se preencher os critérios de aceitação validados. O resultado do
teste será “Inválido” se o SPC não for detectado numa amostra negativa.
O controle de verificação da sonda (PCC) ocorre antes do início da reação
de PCR, quando o sistema GeneXpert Dx mede o sinal de fluorescência das sondas
para monitorar a reidratação das esferas, o enchimento do tubo de reação, a
integridade da sonda e a estabilidade do corante. A verificação da sonda é
aprovada se preencher os critérios de aceitação atribuídos originariamente pelo
fabricante.
O teste de PCR-RT detecta e
ampliam região especifica do DNA da
espécie selvagem do M tuberculosis. (TRM-TB), é um teste de diagnóstico in vitro,
semi-quantitativo, de nested PCR em tempo real, concebido para: Detecção
do DNA do complexo Mycobacterium tuberculosis em amostras de
expectoração ou em sedimentos concentrados preparados a partir de expectorações
induzidas ou expectoradas, em baciloscopias positivas ou negativas; e A
detecção de mutações do gene rpoB, associadas com a resistência à
rifampicina, em amostras de pacientes com risco de resistência à rifampicina. O
teste MTB/RIF destina-se a ser utilizado com amostras de pacientes nunca
tratados de tuberculose anteriormente e com suspeita clínica dessa doença. Procedimento Operacional Padrão CEAMP 2013
A utilização do ensaio Xpert
MTB/RIF para a detecção de M. tuberculosis (MTB) ou para a determinação
da susceptibilidade à rifampicina também não foi validada para pacientes que
estão em tratamento para a tuberculose. O sistema GeneXpert Dx integra e
automatiza o processamento das amostras, a amplificação dos ácidos nucléicos e
a detecção das sequências-alvo das amostras, utilizando ensaios de PCR e RT-PCR
(transcriptase reversa-PCR) em tempo real.
O teste não identifica micobactérias não tuberculosas (MNT). Em caso de
suspeita de MNT, realizar a cultura com identificação de espécie no processo de
investigação diagnóstica.
Os laudos ou resultados dos exames moleculares (PCR-RT) são liberados em
torno de 3 horas com isso agilizando o tratamento; no resultado é informada a
detecção do DNA alvo da espécie selvagem do Mycobacterium tuberculosis e o
nível de detecção : alto, médio, baixo ou muito baixa e também a detecção da
resistência a rifampcina, Mycobacterium tuberculosis: Indeterminado → solicitar novo exame Mycobacterium
tuberculosis:
Detectado. Resistência à Rifampicina:
indeterminado → solicitar novo exame. .
Manual de vigilância laboratorial da tuberculose e outras
Micobácterias 2008
Lembrando que na baciloscopia o
exame é realizado em duas amostras colhidos em dias consecutivos o resultado
liberado em três dias Suspeita de
tuberculose pulmonar ou laríngea em pessoas nunca Previamente tratados (casos novos), os profissionais de saúde deverão encaminhar uma amostra para realização do TRM-TB
no CEAMP Suspeita de tuberculose pulmonar ou laríngea em pessoas que já
receberam tratamento em algum momento da vida, seja retorno após
tratamento ou suspeito de recidiva (retratamentos) os profissionais de saúde devem encaminhar duas amostras de escarro para realização de baciloscopias, do
TRM-TB e de cultura para Mycobactéria com teste de sensibilidade antimicrobiano
(TSA) uma amostra será colhido no momento da identificação do caso suspeito. Os testes moleculares com a tecnologia
usada no CEAMP no momento não é indicado para controle de tratamento e
identificação Mycobacterium não tuberculose
(MNT).
Durante o
acompanhamento dos casos de tratamento continuarão sendo realizadas
baciloscopia de escarro mensalmente e no final do tratamento para documentação
da cura ou indicação de falência da quimioterapia,e resistência as drogas antituberculose.
Considerações finais
Foi avaliado neste trabalho as mudanças positivas favorável ou não na assistência aos paciente e no diagnostico da tuberculose
pulmonar no município do Paulista no
estado de Pernambuco com a implantação das técnicas de biologia molecular e as
adequações no algoritmos de atenção aos pacientes sintomáticos respiratórios e
seus contatos.
. No ano de 2005 foi implantado no laboratório municipal do Paulista o
setor de BK ( bacilo de Koch) baciloscopia para diagnostico micobacteriologico
da tuberculose pulmonar e laríngea através do exame de pesquisa de bacilo
álcool acido resistente (BAAR) realizados em duas amostras de escarro colhida
em dias consecutivos em pacientes sintomáticos respiratórios para diagnostico
de casos novos, com resultados liberados em 24 horas .com média de 12 exames
por dia com produção mensal de 240 exames realizados com o percentual de 4% de
positividade em uma população 200.000 habitantes assistida em 46 unidades
básicas de saúde e duas policlínicas
. Anteriormente a implantação do serviço no município, os pacientes
sintomáticos respiratórios procuravam assistência nos hospitais de referencia
do Estado e o município não realizava notificação, em 2005 foi criada o
departamento de vigilância
epidemiológica e a coordenação para controle da tuberculose.
Em outubro de 2014 foi implantado no
laboratório do município (CEAMP) a técnicas de biologia molecular PCR-RT em
equipamento que extrai, ampliam e detecta o DNA alvo através de 5 sondas com corantes
fluorescentes (brometo de etidio) que se liga ao tipo selvagem. Com uma única amostra de escarro com volume
mínimo de 1 ml o equipamento realiza 58 ciclos (desnaturação, anelamento,
extensão) em quatro amostra de pacientes diferentes simultaneamente em torno de 2 horas e detecta
o gene rpoB com 81 pares de bases que
confere resistência a Rifampicina. A extração do DNA da bactéria é realizado
por sonificação . O teste demonstra a o
grau de detecção do DNA alvo em alto. Médio, baixo e muito baixo e e
visualização através de gráficos.
O índice de confirmação laboratorial
com a tecnologia da PCR-RT apresentou um aumento de 100% com uma media de 16
exames executados por dia e produção mensal de 320 exames de escarro examinados,
com um percentual 12% de positividade, com incidência de .4 pacientes infectado
por 100.000 habitantes. Demonstrado uma aumento nos índices de detecção desta
morbidade no município o tempo de entrega do laudo com prazo de até 24 horas
também foi importante na detecção de casos novos no inicio da infecção evitando
as graves sequelas provocadas pela doença. Fornecendo importante subsídios aos
gestores de saúde para direcionar ações preventivas e de atenção ações ao
diagnostico precoce e controle.
Demonstrando uma melhoria na detecção
de casos novos. O tempo do diagnostico mas rápido promovido pelo emprego da
técnica de PCR-RT facilitando e
agilizando as ações de tratamento e controle da transmissão, com a vantagem
adicional de ser necessário apenas uma amostra de escarro
2005
|
Exames realizados : 2800
|
Positivos: 168
|
Negativo
|
06%
|
2006
|
Exames realizados : 2881
|
Positivos: 115
|
Negativo
|
04%
|
2010
|
Exames realizados: 2890
|
Positivos: 130
|
Negativo
|
4,5%
|
2023
|
Exames realizados: 2881
|
Positivos: 115
|
Negativo
|
04%
|
2015
|
Exames realizados: 3080
|
Positivos: 369
|
Negativo: 2711
|
12%
|
Informe anual por
municipi0 Ministério da saúde 2015
Para os exames de controle de
tratamento e diagnostico de MNT ( Micobacteria não tuberculosas ) continuo
sendo realizadas baciloscopia pela coloração Ziehl Neelsen com uma amostra de
escarro mensal até o termino do tratamento quimioterápico e cultura para
identificação e tipificação da espécie.
Para diagnostico da infecção
latente, fase onde o paciente não
apresenta eliminação do bacilo ( bacilífero) o diagnostico é realizado
com o teste tuberculino.Em pediatria em paciente com TT (reação de Mantoux )
negativo utilizar o escore clinico para definir o diagnostico. E estratégia
terapeutica
Esperamos com esse trabalho
contribuir com subsídios e informações para fomentar as estratégias para
controle ou erradicação da tuberculose no município do Paulista.
.
REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
Manual de baciloscopia da tuberculose Centro de Referência Professor Hélio Fraga, 1ª edição, Rio de Janeiro,
1998. 48p:Il.
Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e outras Micobactérias Ministerio da
Saúde do Brasil Brasilia, DF 2008
Tuberculose Guia de Vigilância Epidemiológica Fundação Nacional de Saúde MS Brasilia, DF 2002
CONDE, marcus,
FITERMAN, Jussara,LIMA, Marina Andrade.Tuberculose
Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tesiologia Rio de Janeiro 2011
Assis, Nelma Cristina Diagnostico Molecular da tuberculose pulmonar 1ª edição, Porto
Alegre, 2007
Bula do kit Xpert MTB/RIF –
GeneXpert ®. Package insert.
Manual do usuário -
Xpert MTB/RIF – GeneXpert ®.
Brasil. Ministério da
Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância
Epidemiológica. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da Tuberculose e
outras Micobactérias. 1º ed. Brasília. 2008.
Organização Mundial da
Saúde. 2011. Policy statement: automated real-time nucleic acid amplification
technology for rapid and simultaneous detection of tuberculosis and rifampicin
resistance: Xpert MTB/RIF system. WHO/HTM/TB/2011.4.
Organização Mundial
da Saúde. 2012. Manual de Biossegurança para Laboratórios da Tuberculose.
WHO/HTM/TB/2012.11.
Organização Mundial
da Saúde. 2014. Xpert MTB/Rif Implementation Manual. Techinical
and Operacional “how to”: practical considerations. WHO/HTM/TB/2014.
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